Sapidyne Instruments Inc.于1995年在美國(guó)創(chuàng)立，產(chǎn)品基于的Kinetic Exclusion Assay（KinExA®）技術(shù)。Sapidyne這個(gè)名字來(lái)源于拉丁語(yǔ)“Sapid”，意味著令人愉悅的想法，而“dyne”則是希臘語(yǔ)力量的意思。 所以Sapidyne意味著一種在智力上令人愉悅的力量。
在公司成立早期，Xavier大學(xué)、美國(guó)和等研究單位采用KinExA技術(shù)開(kāi)展了大量工作；經(jīng)過(guò)數(shù)十年在生物制藥領(lǐng)域、科研領(lǐng)域及環(huán)境監(jiān)測(cè)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，KinExA技術(shù)已成為制藥公司和生物技術(shù)公司以及許多大學(xué)、獨(dú)立研究實(shí)驗(yàn)室和環(huán)境監(jiān)測(cè)機(jī)構(gòu)研究相互作用和生物活性物質(zhì)檢測(cè)的工具，并且得到FDA和EMA認(rèn)可。Sapidyne總部位于美國(guó)愛(ài)達(dá)荷州博伊西，運(yùn)營(yíng)機(jī)構(gòu)遍布。 公司持續(xù)開(kāi)發(fā)的應(yīng)用，不斷推進(jìn)KinExA®技術(shù)的發(fā)展。 隨著公司發(fā)展，我們將持續(xù)重視客戶(hù)的支持和學(xué)習(xí)。 憑借20多年累積的經(jīng)驗(yàn)，KinExA技術(shù)能充分滿足科學(xué)研究、藥物開(kāi)發(fā)、細(xì)胞治療和環(huán)境監(jiān)測(cè)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。
Kinetic Exclusion Assay（KinExA®）技術(shù)
一、平衡態(tài)檢測(cè)
在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，一種結(jié)合分子濃度恒定（Constant Binding Partner,CBP)，另外一種濃度梯度分子（Titrant）與CBP混勻孵育；同時(shí)用Titrant包被磁珠。
A.濃度梯度Titrant與CBP B. 加入抗CBP的熒光抗體， C. 清洗掉非特異熒光
混合物流過(guò)流路，游離的 熒光信號(hào)隨抗體結(jié)合到 信號(hào)，只剩與CBP特異
CBP被流路中磁珠上的 CBP上而增加。 結(jié)合的熒光抗體，測(cè)定
Titrant捕獲。 特異性信號(hào)。
Titrant濃度梯度與游離CBP（即End Signal） 儀器記錄實(shí)時(shí)結(jié)合（A-C）曲線，并自動(dòng)
作圖—游離CBP與Titrant的量有關(guān)，Titrant 將熒光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)；特異性
濃度越高游離CBP越少，信號(hào)越低；擬合 信號(hào)（End Signal）用于曲線擬合。
該曲線可獲得Kd與CBP活性濃度。
二、動(dòng)力學(xué)檢測(cè)
采用平衡態(tài)檢測(cè)中已包被Titrant的磁珠作為動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)的固定相捕獲劑。
KinExA 可以用于檢測(cè)： 數(shù)據(jù)可用于：
完整真核細(xì)胞 FDA審評(píng)
純化和未純化分子 新藥審批申請(qǐng)
解離慢的高親和力分子 申請(qǐng)
活性濃度 基金申請(qǐng)
親和力和動(dòng)力學(xué) 文章發(fā)表
三、KinExA的價(jià)值：新藥研發(fā)成本動(dòng)輒數(shù)十上百億美元，靈敏可靠的儀器在研發(fā)早期即可協(xié)助準(zhǔn)確甄選苗頭候選藥物（hit），減少不必要的支出，降低研發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。由于KinExA可在生理?xiàng)l件下獲取準(zhǔn)確可靠的結(jié)合常數(shù)，具有很高生物相關(guān)性，而且成本極低，目前被很多制藥公司用作主要的驗(yàn)證工具。此外，KinExA的分析軟件可以輕松地解讀候選分子的結(jié)合特征，節(jié)省研究人員的時(shí)間，增加結(jié)果的可靠性。
四、與SPR的區(qū)別：“SPR在芯片表面固定一個(gè)分子，通過(guò)芯片表明與溶液間二維相互作用的物質(zhì)量改變而實(shí)現(xiàn)SPR檢測(cè)。這就帶來(lái)了非常顯著的缺點(diǎn)：固定在芯片上的生物分子可能不能維持其天然活性、質(zhì)量遷移影響動(dòng)力學(xué)分析（例如，流速會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果）、被檢測(cè)分子有分子量下限限制、非常大的分子或者生物結(jié)構(gòu)其分子量有上限限制、樣品需要純化及無(wú)法檢測(cè)完整細(xì)胞。
相反，KinExA分析三維水平及游離狀態(tài)相互作用，不固定任何分子、不會(huì)對(duì)平衡帶來(lái)影響、沒(méi)有質(zhì)量遷移的限制、可以檢測(cè)未純化樣品和完整細(xì)胞；因此，極寬范圍內(nèi)的生物分子、生物結(jié)構(gòu)及完整細(xì)胞均可靈活分析?！?/span>
五、KinExA vs. SPR：
1、與SPR的區(qū)別：SPR在芯片表面固定一個(gè)分子，通過(guò)芯片表明與溶液間二維相互作用的物質(zhì)量改變而實(shí)現(xiàn)SPR檢測(cè)。這就帶來(lái)了非常顯著的缺點(diǎn)：固定在芯片上的生物分子可能不能維持其天然活性、質(zhì)量遷移影響動(dòng)力學(xué)分析（例如，流速會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果）、被檢測(cè)分子有分子量下限限制、非常大的分子或者生物結(jié)構(gòu)其分子量有上限限制、樣品需要純化及無(wú)法檢測(cè)完整細(xì)胞。
相反，KinExA分析三維水平及游離狀態(tài)相互作用，不固定任何分子、不會(huì)對(duì)平衡帶來(lái)影響、沒(méi)有質(zhì)量遷移的限制、可以檢測(cè)未純化樣品和完整細(xì)胞；因此，極寬范圍內(nèi)的生物分子、生物結(jié)構(gòu)及完整細(xì)胞均可靈活分析
2、與SPR技術(shù)的對(duì)比：為了表征治療性單克隆抗體候選分子，研究者采用不同類(lèi)型芯片，從Biacore系統(tǒng)獲得同一組單抗-抗原的53組數(shù)據(jù)，與KinExA實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，親和力及動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)與所使用的芯片類(lèi)型有關(guān)，帶負(fù)電荷的CM5,CM4及CM1芯片對(duì)Biacore的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)有不利的影響。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，作者通過(guò)Biacore液相實(shí)驗(yàn)，KinExA平衡態(tài)滴定以及KinExA動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)，精確計(jì)算抗體與抗原的親和力及動(dòng)力學(xué)參數(shù)。結(jié)果表明隨著芯片表面負(fù)電荷的降低，親和力及動(dòng)力學(xué)參數(shù)與液相實(shí)驗(yàn)所得的結(jié)果越接近。可能的原因：（1）帶負(fù)電荷的葡聚糖芯片與抗體之間的空間位阻影響抗原的結(jié)合；（2）帶負(fù)電荷的抗原與芯片表面的負(fù)電荷靜電排斥。
表中結(jié)果表明：對(duì)于Biacore技術(shù)，不同的固定方式（氨基偶聯(lián)，捕獲）以及不同的芯片，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均有明顯影響。而采用KinExA技術(shù)，溶液中加葡聚糖，對(duì)結(jié)果也無(wú)明顯影響。
圖A,圖B均采用KinExA技術(shù)檢測(cè)。圖A中buffer不含葡聚糖，KD=24.7pM；圖B中buffer加入葡聚糖，KD=33.2pM。
圖C，圖D均采用Biacore技術(shù)檢測(cè)。圖C采用氨基偶聯(lián)的方式CM5芯片固定抗體，KD=2.05nM；圖D采用捕獲的方式CM5芯片固定抗體，KD=2.86nM
六、案例
案例一：完整細(xì)胞的相互作用檢測(cè)
<背景>：?jiǎn)慰寺】贵wXMetA是胰島素受體（IR）變構(gòu)部分的激動(dòng)劑，其激活代謝Akt激酶信號(hào)通路，而對(duì)有絲分裂胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）信號(hào)通路幾乎沒(méi)有影響。為了研究這種選擇性信號(hào)通路的性質(zhì)，作者驗(yàn)證了XMetA對(duì)CHO細(xì)胞中IR，Akt和ERK的特異性磷酸化和活化的影響。
<目的>：完整細(xì)胞親和力檢測(cè)。
<方法>：研究者將表達(dá)短鏈型（IR-A）及長(zhǎng)鏈型（IR-B）胰島素受體的不同濃度CHO細(xì)胞分別與XMetA孵育，通過(guò)離心獲得游離的XMetA，用KinExA儀器檢測(cè)親和力。另外，作者采取同樣的策略，用KinExA儀器檢測(cè)胰島素與CHO細(xì)胞表面IR-A，IR-B的親和力。
<結(jié)論>：XMetA與IR-A亞型的親和力為55±16pM，與IR-B亞型的親和力為50±11pM。另外，在對(duì)照抗體組，胰島素與IR-A亞型的親和力為156±14pM；在XMetA組，胰島素與IR-A亞型的親和力為216±100pM；在對(duì)照抗體組，胰島素與IR-B亞型的親和力為221±28pM；在XMetA組，胰島素與IR-B亞型的親和力為277±112pM。數(shù)據(jù)同時(shí)說(shuō)明， XMetA與IR亞型的結(jié)合與胰島素?zé)o關(guān)。
圖A，圖B通過(guò)KinExA技術(shù)檢測(cè)胰島素對(duì)XMetA與表達(dá)IR-A，IR-B的CHO細(xì)胞結(jié)合的影響；
圖C，圖D通過(guò)KinExA技術(shù)檢測(cè)XMetA對(duì)胰島素與表達(dá)IR-A，IR-B的CHO細(xì)胞結(jié)合的影響。
案例二：細(xì)胞與上清未純化樣品檢測(cè)
<背景>：?jiǎn)慰寺】贵w（mAb）在體內(nèi)與膜蛋白間親和力的可靠評(píng)估是的主要問(wèn)題。在BV展示系統(tǒng)中，膜蛋白能以天然狀態(tài)在病毒表面展示。
<目的>：細(xì)胞與上清中未純化樣品親和力檢測(cè)。
<方法>：研究者基于KinExA技術(shù)，結(jié)合桿狀病毒（BV）膜蛋白展示系統(tǒng)，描述了一個(gè)簡(jiǎn)單而高度敏感的單克隆抗體評(píng)估方法。
<結(jié)論>：在BV表面展示的肝癌抗原Robo1吸附到磁珠上（BV beads）,其KD值(~10pM)與全細(xì)胞分析方法一致（R2=0.998），表明基于KinExA技術(shù)檢測(cè)方法提供了針對(duì)細(xì)胞表面蛋白的單克隆抗體親和力準(zhǔn)確的評(píng)估。
上圖中顯示的是KinExA實(shí)驗(yàn)中所使用的抗原。A圖中可溶性Robo1用于標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)分析；B圖中表達(dá)天然活性Robo1的CHO細(xì)胞用4%多聚甲醛固定，用于細(xì)胞分析實(shí)驗(yàn)；C圖中表達(dá)天然活性Robo1的BV磁珠用于BV展示分析
下圖采用KinExA技術(shù)檢測(cè)抗Robo1抗體與抗原的親和力。曲線上方的數(shù)字代表抗體的活性濃度。
七、儀器型號(hào)
1、KinExA 4000可以檢測(cè)細(xì)胞（天然的和工程化的）、非純化樣品、血清樣品，小分子等的相互作用和親和力。 四個(gè)顆粒儲(chǔ)存器可容納四種不同的固相劑，并可與多達(dá)270個(gè)樣品一起支持長(zhǎng)時(shí)間的無(wú)人值守操作。 與其他生物傳感器不同，KinExA能夠測(cè)量生理相關(guān)條件下的相互作用。
2、KinExA 3100 / 3200 也是基于動(dòng)態(tài)排阻分析技術(shù)開(kāi)發(fā)的一種特殊性平臺(tái)。儀器超高的靈敏性來(lái)源于其具有技術(shù)的流路，高質(zhì)量的管路及超敏的光學(xué)系統(tǒng)。通過(guò)KinExA儀器能獲得精確，靈敏，可靠的數(shù)據(jù)。
3、自動(dòng)進(jìn)樣器使用靈活，可無(wú)人置守長(zhǎng)時(shí)間操作多個(gè)實(shí)驗(yàn)，為KinExA儀器使用者提高工作效率。顆粒儲(chǔ)存器能容納四種不同的固相劑，可支持多達(dá)270個(gè)樣品的自動(dòng)操作。KinExA Pro軟件用于實(shí)驗(yàn)程序的設(shè)計(jì)，可以設(shè)置開(kāi)始檢測(cè)時(shí)間以及孵育時(shí)間。
八、KinExA參考文獻(xiàn)
1、2018年日本東京大學(xué)高級(jí)科學(xué)技術(shù)研究中心定量生物學(xué)和醫(yī)學(xué)系Osamu Kusano-Arai等老師利用KinExA 3200 (Sapidyne Instruments Inc.)在《單克隆抗體在免疫診斷和中的應(yīng)用(Monoclonal Antibodies in Immunodiagnosis and Immunotherapy)》上發(fā)表《對(duì)一種抗體可以識(shí)別CDH17上不同表位的免疫毒素混合物的胃癌細(xì)胞的協(xié)同細(xì)胞毒性影響》，該研究結(jié)果表明，以多種表位為靶點(diǎn)的免疫毒素復(fù)合物對(duì)低表達(dá)水平細(xì)胞具有協(xié)同作用，擴(kuò)大了腫瘤免疫毒素治療的適用范圍。
2、2018年Eric S. Furfine博士等人利用KinExA 儀器 (Sapidyne Instruments Inc.)在《Eye & Contact Lens》上發(fā)表《EBI-005的臨床前開(kāi)發(fā):一種IL-1受體-1抑制劑，用于眼表炎性疾病的局部治療》，該研究對(duì)小鼠和兔的受體親和力、藥物生物利用度、免疫原性反應(yīng)、安全性和耐受性進(jìn)行了評(píng)估。
3、2017年Jonathan K. Fleming和Jonathan M. Wojciak利用KinExA 3200 (Sapidyne Instruments Inc.)在《分子生物學(xué)方法(Methods in Molecular Biology)》上發(fā)表《測(cè)定1-磷酸鞘氨醇：動(dòng)力學(xué)排斥試驗(yàn)的蛋白質(zhì)相互作用》，由于缺乏固有的可追溯特性(如熒光或UV/Vis吸收)，確定與溶磷脂結(jié)合的蛋白(如S1P)的準(zhǔn)確、可靠的平衡解離常數(shù)的能力具有挑戰(zhàn)性。通過(guò)共價(jià)鍵或衍生化修飾S1P可能改變蛋白質(zhì)識(shí)別[1]的溶解性和/或自然模式。此外，由于S1P在水介質(zhì)中表現(xiàn)出較差的溶解度特性，依賴(lài)于游離和結(jié)合S1P物種的物理分離的結(jié)合研究可能是困難的。然而，為了支持蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，水介質(zhì)是必需的。該文章中描述的KinExA方法克服了上面研究蛋白質(zhì)-脂類(lèi)相互作用的問(wèn)題，并闡明了使用載體蛋白遞送溶磷脂的效果。
4、2017年清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部Hanqiu Zheng等老師利用KinExA 技術(shù)在《CellPress》上發(fā)表《治療抗體靶向腫瘤和生態(tài)位衍生Jagged1使骨轉(zhuǎn)移對(duì)敏感》，作者報(bào)道了針對(duì)Jagged1(克隆15D11)的高效單克隆抗體的發(fā)展。15D11除了對(duì)Jagged1表達(dá)的腫瘤細(xì)胞骨轉(zhuǎn)移的抑制作用外，對(duì)的骨轉(zhuǎn)移也有明顯的敏感性，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞中Jagged1的表達(dá)，為癌細(xì)胞提供生存空間。使用了成骨細(xì)胞特異性的Jagged1轉(zhuǎn)基因小鼠模型，作者進(jìn)一步證實(shí)了骨母細(xì)胞Jagged1的骨轉(zhuǎn)移功能。這些發(fā)現(xiàn)確立了15D11作為預(yù)防或治療骨轉(zhuǎn)移的潛在治療藥劑。
5、2007年清華大學(xué)化學(xué)工程系Feng-yi Su等老師利用KinExA 3000 (Sapidyne Instruments Inc.)在《生物傳感器與生物電子學(xué)(Biosensors and Bioelectronics)》上發(fā)表《基于流式動(dòng)力學(xué)排斥熒光免疫分析，簡(jiǎn)單靈敏的細(xì)菌定量》，證明KinExA是細(xì)菌測(cè)定的可靠和有希望的替代方法。然而，與其他免疫測(cè)定方法一樣，這種方法的可達(dá)到的檢出限受到抗體與抗原的親和性的限制。通過(guò)增加抗體對(duì)目標(biāo)細(xì)菌的特異性，使用KinExA可以提高檢測(cè)靈敏度，并且?guī)缀鯖](méi)有交叉反應(yīng)性的抗體在復(fù)雜群落中的細(xì)菌測(cè)定的應(yīng)用中是潛在候選者。
KinExA部分參考文獻(xiàn)
親和力和動(dòng)力學(xué)檢測(cè):
KinExA技術(shù)概述:
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液相中檢測(cè)非純化樣品:
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與SPR比較:
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高親和力檢測(cè):
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逆向檢測(cè):
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未純化抗原檢測(cè):
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免疫檢測(cè)技術(shù):
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